ซาโปนิน (Saponins)

Page 11 of 13

การวิเคราะห์ปริมาณซาโปนิน (Quantitative analysis of saponins)

วิธีทางโครมาโตกราฟีเป็นวิธีที่ดีสำหรับแยกซาโปนินแต่ละชนิดเพื่อตรวจหาปริมาณของซาโปนินจะใช้ควบคู่กับการตรวจวัดด้วยวิธีสเปกโตรโฟโตเมตริก (spectrophotometric method) และวิธีทางชีวภาพ (biological method) ซึ่งวิธีทางชีวภาพและสเปกโตรโฟโตเมตริกก็ไม่สามารถให้ข้อมูลที่ถูกต้องเนื่องจากโครงสร้างของซาโปนินมีความหลากหลายจึงมีวิธีดีกว่าดังนี้ คือ

1. Thin-layer chromatography-Densitometer (TLC-densitometer) เป็นเทคนิคที่ใช้ในการแยกและตรวจหาซาโปนินที่สกัดจากพืชหลายชนิด โดยการวัดความหนาแน่น (Densitometry) ปัญหาหลักของวิธีนี้คือ ต้องทำสารมาตรฐานควบคู่ไปกับตัวอย่างในทุกแผ่นTLC เพื่อลดความแปรผันระหว่างแผ่นและสีที่เกิดปฏิกิริยาจากสารที่ใช้พ่น (spraying reagent) อีกทั้งการตรวจวัดจุดหรือตำแหน่งของสารต้องใช้ซอฟแวร์ที่มีความไวสูงในการสแกน แผ่นกระจกที่เคลือบด้วยซิลิกาเจลซึ่งถูกเป็นส่วนที่อยู่นิ่ง (stationary phase) ในการแยกส่วนที่เคลื่อน (mobile phase) หรือ developing system ประกอบด้วยส่วนผสมของ chloroform-methanol-water หรือ butanol-acetic acid-water สำหรับวิเคราะห์ซาโปนินและ benzene-acetone สำหรับวิเคราะห์อะไกลโคน spraying reagent ที่ใช้ ได้แก่ phosphotungstic acid, 10% sulfuric acid ใน ethanol และ 0.5% p-anisaldehyde 1% sulfuric acid ใน acetic acid ความสัมพันธ์เชิงเส้นระหว่าง peak area และปริมาณสารมาตรฐานของซาโปนินพบว่าอยู่ในช่วง 1-5 ไมโครกรัมต่อจุดโดยมีค่า recovery 98% ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน 3-5% เมื่อเปรียบเทียบกับวิธี HPLC พบว่า เป็นวิธีที่ถูกต้องเพียงพอสำหรับการเฝ้าระวังและควบคุมคุณภาพและเหมาะสำหรับการตรวจเป็นชุด 2D-TLC สามารถใช้ตรวจสารสกัดซาโปนินได้ 35 ชนิดจากต้น ใบโสมและซาโปนินจาก Calendula officinalis เทคนิคนี้ยังใช้ตรวจหา glycyrrhizic acid ในสารสกัดจากชะเอมเทศ panaxadiol และ panaxatriol ในโสมและซาโปนินจาก Avena sativa วิธีนี้สามารถใช้ตรวจตัวอย่างได้เป็นจำนวนมากโดยไม่ต้องมีการทำความสะอาดตัวอย่างก่อนการวิเคราะห์ จึงเป็นวิธีที่แนะนำสำหรับการควบคุมคุณภาพของยาที่ดี (Oleszek, WA., 2002)

2. TLC-colorimetry การวิเคราะห์ซาโปนินทางคุณภาพและปริมาณสามารถทำด้วยการวัดสี โดย ซาโปนินแต่ละชนิดจะถูกแยกออกเป็นแถบสีด้วยเทคนิค TLC แถบเหล่านี้จะถูกสกัดเอาซาโปนินออกด้วยแอลกอฮอล์ สารสกัดที่ได้จะนำไปทำปฏิกิริยากับรีเอเจนต์ตัวอื่นเพื่อทำให้เกิดสี ได้แก่ Ehrlich หรือ vanilla reagent และวัดสีที่ความยาวคลื่น 515- 560 nm ข้อเสียของวิธีนี้คือ สารบางตัวที่อยู่ในสารสกัด เช่น sterol และกรดน้ำดีที่มีหมู่ไฮดรอกซิล(OH) ที่ตำแหน่ง C-3 อาจเกิดสีกับรีเอเจนต์ได้ทำให้การวิเคราะห์ไม่ถูกต้อง anisaldehyde-sulfuric acid-ethyl acetate reagent สามารถเกิดสีกับสเตียรอยด์ซาโปจินินโดยไม่ถูกรบกวนจากสารอื่นและอาจใช้ reverse-phase cleanup ก่อนการวิเคราะห์ด้วยวิธีนี้เพื่อปรับปรุงให้มีประสิทธิภาพเพิ่ม ทั้งนี้ขึ้นกับธรรมชาติของซาโปนินด้วย (Oleszek, WA., 2002)

3. Gas liquid chromatography (GC) วิธีนี้ใช้ในการวิเคราะห์สารที่สามารถระเหยเป็นไอได้ เนื่องจากซาโปนินเป็นสารที่มีโมเลกุลขนาดใหญ่และมีขั้วจึงไม่สามารถระเหยเป็นไอได้ง่าย ทำให้มีความจำเป็นต้องเปลี่ยนให้อยู่ในสภาพที่ระเหยได้ง่ายก่อน โดยเปลี่ยนให้อยู่ในรูปของเอซิล (acyl), เมทิล (methyl) หรือไตรเมทิลไซลิลอีเทอร์ (trimethylsilyl ether) การวิเคราะห์โดยวิธี GC นี้ ขั้นแรกซาโปจินินถูกย่อยสลายเป็นอะไกลโคน ซึ่งจุดนี้มีความสำคัญเนื่องจากผลที่ได้จากการย่อยสลายจะขึ้นอยู่กับโครงสร้างของซาโปนิน เวลาและสภาวะของการย่อยสลาย การย่อยสลายซาโปนินไปเป็นซาโปจินินที่สมบูรณ์นี้เป็นกุญแจสำคัญในการวิเคราะห์ปริมาณของซาโปนิน นอกจากนี้ยังมีซาโปนินหลายชนิดที่ให้ซาโปจินินที่ไม่ตรงกับโครงสร้างเดิม เช่น การเกิดปฏิกิริยาการแยกสลายด้วยน้ำ (hydrolysis) ของ soyasaponin และอัลฟัลฟา และซาโปนินในพืชตระกูลถั่ว (legumes) จนเกิดเป็นอะไกลโคน ทั้งนี้ปริมาณที่เกิดของอะไกลโคนขึ้นอยู่กับเวลาในการเกิด hydrolysis และชนิดของสารที่ใช้ในปฏิกิริยา hydrolysis (Oleszek, WA., 2002)

4. High performance liquid chromatography (HPLC) วิธีนี้เป็นวิธีที่ดีและใช้กันมากวิธีหนึ่งในการวิเคราะห์ซาโปนินและซาโปจินิน เนื่องจากเป็นวิธีที่เหมาะสำหรับสารที่ไม่ระเหยและสารที่มีความเป็นขั้วสูง การแยกใช้ normal phase (silica gel) และ reversed-phase (C-8, C-18) ในบางครั้งต้องมีการดัดแปลง stationary phase เนื่องจาก reversed-phase (C-8, C-18) ไม่สามารถแยกซาโปนินบางชนิดได้ การตรวจวัดโดยใช้แสง UV ทำได้ในช่วงของความยาวคลื่น 200-210 nm เนื่องจากที่ความยาวคลื่นแสงช่วงนี้ไม่มีหมู่ที่ทำให้เกิดสี (chromophore) และความสามารถในการตรวจวัดขึ้นอยู่กับธรรมชาติของซาโปนินเอง เช่น ต้องใช้ถึง 300 นาโนกรัมสำหรับวิเคราะห์ซาโปนินจากโสม การตรวจวัดที่ช่วงของความยาวคลื่นแสงสั้นนี้ทำให้มีข้อจำกัดในการใช้ตัวทำละลายที่เป็น mobile phase ดังนั้นจึงนิยมใช้ acetonitrile ผสมกับน้ำโดยเพิ่มอัตราส่วนทีละน้อยโดย acetonitrile สามารถดูดซึมได้น้อยที่ความยาวคลื่นแสงต่ำกว่าเมื่อเปรียบเทียบกับเมทานอล นอกจากนี้ยังมีอีกหนึ่งทางเลือกนอกจากการใช้ความยาวคลื่นต่ำคือ วิธี pre-column derivatisation โดยการเติม chromophore เข้าไปในโมเลกุลก่อนที่จะผ่านเข้าคอลัมน์เพื่อให้สามารถดูดกลืนคลื่นแสงในช่วงที่ยาวขึ้นได้ (254 nm) (Oleszek, WA., 2002)

5. Capillary electrophoresis (CE) เป็นเทคนิคที่เหมาะสมสำหรับการแยกและหาปริมาณของสารพฤกษเคมี (phytochemicals) ที่หลากหลายในพืช โดยใช้เวลาในการแยกเร็ว (1-30 นาที) ใช้ตัวอย่างน้อยมาก (นาโนลิตร) และใช้รีเอเจนต์ที่เข้าทำปฏิกิริยาน้อยเมื่อเทียบกับวิธีอื่นๆ แต่การใช้ปริมาณตัวอย่างน้อยและความเข้มข้นสูงเพื่อทำการตรวจวัดถือเป็นข้อจำกัดของวิธีนี้ ทำให้วิธีนี้ยังไม่แพร่หลายเท่าที่ควร การทดลองใช้วิธี CE พบว่า ความเข้มข้นของบัฟเฟอร์ (นิยมใช้บอเรต) และอุณหภูมิที่เหมาะสมคือ 150 มิลลิโมลและที่อุณหภูมิห้อง ตามลำดับ (Oleszek, WA., 2002)